实验1 糖的呈色反应和还原糖的检验
一、实验目的
1.学习鉴定糖类及区分酮糖和醛糖的方法。
2.了解鉴定还原糖的方法及其原理。
二、实验原理
糖经浓无机酸处理，脱水产生糠醛或糠醛衍生物。戊糖形成糠醛，己糖则形成羟甲基糠醛。
这些糠醛和糖醛衍生物在浓无机酸作用下，能与酚类化合物缩合生成有色物质。与一元
酚如α一萘酚作用，形成三芳香环甲基有色物质。与多元酚如间苯二酚作用，则形成氧杂蒽有色物质，反应式如下：
通常使用的无机酸为硫酸。如用盐酸，则必须加热。常用的酚类为α一萘酚、甲基苯二酚、间苯二酚和间苯三酚等，有时也用芳香胺、胆酸、某些吲哚衍生物和一些嘧啶类化合物等。
有人认为，用浓硫酸作为脱水剂时，形成有颜色的产物与酚核的磺化有关，见如下反应式；
（一）糖的呈色反应
1．Molish反应(α～萘酚反应)
本实验是鉴定糖类最常用的颜色反应。糖在浓酸作用下形成的糠醛及其衍生物与α一萘酚作用，形成红紫色复合物。在糖溶液与浓硫酸两液面间出现紫环，因此又称紫环反应。自由存在和结合存在的糖均呈阳性反应。此外，各种糠醛衍生物、葡萄糖醛酸、丙酮、甲酸、乳酸等皆呈颜色近似的阳性反应。因此，阴性反应证明没有糖类物质的存在；而阳性反应，则说明有糖存在的可能性，需要进一步通过其他糖的定性试验才能确定有糖的存在。
2．蒽酮反应
糖经浓酸水解，脱水生成的糠醛及其衍生物与蒽酮(10一酮一9，10一二氢蒽)反应生成蓝一绿色复合物。
3. Seliwanoff反应(间苯二酚反应)
该反应是鉴定酮糖的特殊反应。在酸作用下，己酮糖脱水生成羟甲基糠醛。后者与间苯二酚结合生成鲜红色的化合物，反应迅速，仅需20—30s。在同样条件下，醛糖形成羟甲基糠醛较慢。只有糖浓度较高时或需要较长时间的煮沸，才给出微弱的阳性反应。蔗糖被盐酸水解生成的果糖也能给出阳性反应。
4．Bial反应(甲基间苯二酚反应)
戊糖与浓盐酸加热形成糠醛，在有Fe3+存在下，它与甲基间苯二酚(地衣酚)缩合，形成深蓝色的沉淀物。此沉淀物溶于正丁醇。己糖也能发生反应，但产生灰绿色甚至棕色的沉淀物。
（二）还原糖的鉴定
含有自由醛基(一CHO)或酮基(>C==O)的单糖和二糖为还原糖。在碱性溶液中，还原糖能将金属离子(铜、铋、汞、银等)还原，糖本身被氧化成酸类化合物，此性质常用于检验糖的还原性，并且常成为测定还原糖含量的各种方法的依据。
1．Fehling反应
费林试剂是含有硫酸铜与酒石酸钾钠的氢氧化钠溶液。硫酸铜与碱溶液混合加热，则生成黑色的氧化铜沉淀。若同时有还原糖存在，则产生黄色或砖红色的氧化亚铜沉淀。上述反应可用下列方程式表示：
在碱性条件下，糖不仅发生烯醇化、异构化等作用。也能发生糖分子的分解、氧化、还原或多聚作用等。由这些作用所形成的复杂混合物具有强烈的还原作用，因此企图用简单的氧化还原作用来写出反应平衡式是不可能的。
为了防止铜离子和碱反应生成氢氧化铜或碱性碳酸铜沉淀，Fehling试剂中加入酒石酸钾钠，它与Cu2+形成的酒石酸钾钠络合铜离子是可溶性的络离子，该反应是可逆的。平衡后溶液内保持一定浓度的氢氧化铜。费林试剂是一种弱的氧化剂，它不与酮和芳香醛发生反应。
2. Benedict反应
Benedict试剂是Fehling试剂的改良。它利用柠檬酸作为Cu2+的络合剂，其碱性比Fehling试剂弱，灵敏度高，干扰因素少，因而在实际应用中有更多的优点。
3．Barfoed反应
该反应的特点是在酸性条件下进行还原作用。在酸性溶液中，单糖和还原二糖的还原速度有明显差异。单糖在3min内就能还原Cu2+而还原二糖则需20min。所以，该反应可用于区别单糖和还原二糖。当加热时间过长，非还原性二糖被水解也能呈现阳性反应，如蔗糖在10 min内水解而发生反应。还原二糖浓度过高时，也会很快呈现阳性反应，若样品中含有少量氯化钠也会干扰此反应。
三、实验试剂和材料仪器
1.测试糖液
2％阿拉伯糖，葡萄糖，果糖，麦芽糖，蔗糖，1％淀粉溶液和2种未知糖液。
2.试剂
①Molish 氏试剂
称取α－萘酚2克，溶于95％乙醇中并定容到100ml。注意临用前，新鲜配制，贮于棕色瓶中。
②蒽酮(Anthrone)试剂
溶解0.2g蒽酮于100mL浓硫酸(A.R．，比重1.84，含量95%)中。当日配制、使用。
③Fehling氏试剂
试剂A：将34.5g硫酸铜(CuSO4·5H20)溶于500mI。蒸馏水中。
试剂B：将125g氢氧化钠和137g酒石酸钾钠溶于500mL蒸馏水中，储于带橡皮塞瓶中。临用时，将试剂A和B等量混合。
④Benedict氏试剂
溶解85g柠檬酸钠(Na3C6HO，·llH20)及50g无水碳酸钠于400mI。水中；另溶8.5g硫酸铜于50mL。热水中。将硫酸铜溶液缓缓倾人柠檬酸钠一碳酸钠溶液中，边加边搅，如有沉淀，可过滤．本试剂可长期使用。如放置过久，出现沉淀．可取用其上清液。
⑤Bial氏试剂
溶解1.5g地衣酚(orcin01)于500mL，浓盐酸并加20—30滴10％三氯化铁溶液。
⑥Seliwanoff氏试剂
溶解50mg问苯二酚(resorcin01)于100rnl．，盐酸(盐酸：水=1:2V／V)中。临用前配制。
盐酸浓度不宜超过12％，否则，它将导致糖形成糠醛或其衍生物。
⑦浓硫酸。
3.器材
试管，试管架，煤气灯和沸水浴等。
四、实验方法
（一）.糖的呈色反应
1．Molish反应
取8支已标号的试管，分别加入各种测试糖液lmL(约15滴)，再各加入Molish试剂2滴，摇匀。逐一将试管倾斜，分别沿管壁慢慢加入浓硫酸l mL，然后，小心竖直试管，使糖液和硫酸清楚地分为两层，观察交界处颜色变化。如几分钟内无呈色反应，可在热水浴中温热几分钟。记录各管出现的颜色，说明原因，检定未知糖液。
2．蒽酮反应
取8支标号的试管，分别加入lmL蒽酮溶液，再将测试糖液分别滴加到各试管内，混匀，观察颜色变化，鉴定未知糖液。
3．Seliwanoff反应
取试管8支，编号，各加人Seliwanoff试剂ImL。再依次分别加入测试糖液各4滴，混匀，同时放人沸水浴中，比较各管颜色变化及出现颜色的先后顺序，分析说明原因。注意
蔗糖的反应。
4. bial反应
将2滴测试糖液加到装有1ml Bial试剂的试管中,沸水浴中加热,观察颜色变化.
如遇到未知糖呈色不明显,可以3倍体积水稀释,并加入1ml戊醇,摇动,醇液呈蓝色,即为阳性反应。
（二）还原糖的鉴定
1．Fehling反应
取8支试管，各加Fehling试剂A和B各lmL。摇匀后，分别加人测试糖液各4滴，沸水浴煮2—3min，取出冷却，观察沉淀和颜色的变化。
2. Benedict反应
于8支试管中先各加入Benedict试剂2ml,再分别加入测试糖各4滴,沸水浴中煮2-3min,冷却后,观察颜色变化.
3.barfoed反应
分别加入测试糖液2-3滴到含有1ml Barfoed试剂的试管中,煮沸约3min,放置20min以上,比较各管颜色变化及红色出现的先后顺序.
五、注意事项
1. Molisch反应非常灵敏，0．001％葡萄糖和0．0001％蔗糖即能呈现阳性反应。因此，
不可使碎纸屑或滤纸毛混入样品中。过浓的果糖溶液，由于硫酸对它的焦化作用，将呈现红色及褐色而不呈紫色。需稀释糖溶液后重做。
2.果糖在Seliwanoff。试剂中反应十分迅速，呈鲜红色，而葡萄糖所需时间长，且只能产生黄色至淡红色。戊糖亦与Seliwanoff试剂反应，戊糖经酸脱水生成糠醛，与间苯二酚缩合。生成绿色到蓝色产物。
3.酮基本身并没有还原性，只有在变为烯醇式后，才显示还原作用。
4.糖的还原作用生成氧化亚铜沉淀的颜色决定于颗粒的大小，Cu2O颗粒的大小又决定于反应速度。反应速度快时，生成的Cu2O颗粒较小，呈黄绿色；反应慢时，生成的Cu2O颗粒较大，呈红色。有保护胶体存在时，常生成黄色沉淀。实际生成的沉淀含有大小不同的Cu2O颗粒，因而每次观察到颜色可能略有不同。溶液中还原糖的浓度可以从生成沉淀的多少来估计，而不能依据沉淀的颜色来区别。
5.Barfoed反应产生的Cu2O沉淀聚集在试管底部，溶液仍为深蓝色。应注意观察试管底部红色的出现，它与一般还原性实验不相同，观察不到反应液由蓝色变绿变黄或变红的过程。
六、思考题
1．列表总结和比较本实验7种颜色反应的原理及其应用。
2．应用Molish反应和Seliwanoff反应分析未知样品时，应注意些什么问题?
3．举例说明哪些糖属于还原糖。
4．运用本实验的方法，设计一个鉴定未知糖的方案。
5．牛乳中含有5％双糖。如何证明牛乳中有双糖存在?这种双糖是什么糖?请选用一些颜色反应来加以鉴定。
第二篇：糖的呈色反应
糖的呈色
一、目的要求：
? (1) 学习鉴定糖类及区分酮糖和醛糖的方法。
(2) 了解鉴定还原糖的方法及其原理。
二、实验步骤:
（一）. Molish反应——α-萘酚反应
? 1.实验原理
糖在浓硫酸或浓盐酸的作用下脱水形成糠醛及其衍生物与α-萘酚作用形成紫红色复合物，在糖液和浓硫酸的液面间形成紫环，因此又称紫环反应。自由存在和结合存在的糖均呈阳性反应。此外，各种糠醛衍生物、葡萄糖醛酸以及丙酮、甲酸和乳酸均呈颜色近似的阳性反应。因此，阴性反应证明没有糖类物质的存在；而阳性反应，则说明有糖存在的可能性，需要进一步通过其他糖的定性试验才能确定有糖的存在。
? 2.试剂
Molish试剂：取5g α-萘酚用95%乙醇溶解至100mL，临用前配制，棕色瓶保存。
1%葡萄糖溶液；1%蔗糖溶液；1%淀粉溶液。
? 3.操作方法
取试管，编号，分别加入各待测糖溶液1 mL，然后加两滴Molish
试剂，摇匀。倾斜试管，沿管壁小心加入约1mL浓硫酸，切勿摇动，小心竖直后仔细观察两层液面交界处的颜色变化。用水代替糖溶液，重复一遍，观察结果。
? （二）蒽酮反应
1.实验原理
糖经浓酸作用后生成的糠醛及其衍生物与蒽酮（10-酮-9，10-二氢蒽） 作用生成蓝绿色复合物。
2.试剂
蒽酮试剂：取0.2g 蒽酮溶于100mL 浓硫酸中，当日配制。 待测糖溶液，同Molish试验。
3.操作方法
取试管，编号，均加入1mL蒽酮溶液，再向各管滴加2 ~ 3滴待测糖溶液，充分混匀，观察各管颜色变化并记录。
（三）. Fehling试验
1.实验原理
费林试剂是含有硫酸铜和酒石酸钾钠的氢氧化钠溶液。硫酸铜与碱溶液混合加热，则生成黑色的氧化铜沉淀。若同时有还原糖存在，则产生黄色或砖红色的氧化亚铜沉淀。
为防止铜离子和碱反应生成氢氧化铜或碱性碳酸铜沉淀，Fehlin试
剂中加入酒石酸钾钠，它与Cu2＋形成的酒石酸钾钠络合铜离子是可溶性的络离子，该反应是可逆的。平衡后溶液内保持一定浓度的氢氧化铜。费林试剂是一种弱的氧化剂，它不于酮和芳香醛发生反应。
? 2.试剂
试剂甲：称取34.5g硫酸铜溶于500mL蒸馏水中。
试剂乙：称取125g NaOH 137g酒石酸钾钠溶于500mL蒸馏水中，贮存于具橡皮塞玻璃瓶中。临用前，将试剂甲和试剂乙等量混合。
1%葡萄糖溶液；1%蔗糖溶液；1%淀粉溶液。
? 3.操作方法
取试管，编号，各加入Fehlin试剂甲和乙1mL。摇匀后，分别加入4滴待测糖溶液，置沸水浴中加热2 ~ 3min，取出冷却，观察沉淀和颜色变化。
（四）酮糖的Seliwanoff反应
? 1.实验原理
该反应是鉴定酮糖的特殊反应。酮糖在酸的作用下较醛糖更易生成羟甲基糠醛。后者与间苯二酚作用生成鲜红色复合物，反应仅需20-30秒。醛糖在浓度较高时或长时间煮沸，才产生微弱的阳性反应。
? 2.试剂
Sediwanoff试剂：0.5g 间苯二酚溶于1升盐酸
（H2O∶HCl=2∶1）(V/V)中，临用前配制。
1%葡萄糖；1%蔗糖；1%果糖。
? 3.操作方法
取试管，编号，各加入Sediwanoff试剂1mL，再依次分别加入待测糖溶液各4滴，混匀，同时放入沸水浴中，比较各管颜色的变化过程。
?
? 注意事项 （1）Molish反应非常灵敏，0.001％葡萄糖和0.0001％蔗糖即
能呈现阳性反应。因此，不可在样品中混入纸屑等杂物。当果糖浓度过高时，由于浓硫酸对它的焦化作用，将呈现红色及褐色而不呈紫色，需稀释后再做。
? （2）果糖与Seliwanoff试剂反应非常迅速，呈鲜红色，而葡
萄糖所需时间较长，且只能产生黄色至淡黄色。戊糖亦与
Seliwanoff试剂反应，戊糖经酸脱水生成糠醛，与间苯二酚缩合，生成绿色至蓝色产物。
? （3）酮基本身没有还原性，只有在变成烯醇式后，才显示还原
作用。
（4）糖的还原作用生成氧化亚铜沉淀的颜色决定于颗粒的大小，Cu2O颗粒的大小又决定于反应速度。反应速度快时，生成
的Cu2O颗粒较小，呈黄绿色；反应速度慢时，生成的Cu2O颗粒
较大，呈红色。溶液中还原糖的浓度可以从生成沉淀的多少来估计，而不能依据沉淀的颜色来判断。